RAW264.7细胞用含50ng/mLRANKL的培养基培养6d，如图4所示，水平素D疏松RAW264.7细胞可诱导为圆形、染料椭圆形或不规则多核破骨细胞，木素并在细胞周围可以看到凸起的维生伪足。表明RAW264.7细胞可诱导为成熟的骨质破骨细胞用于试验。
通过MTT法测定染料木素和维生素D3作用6d对RAW264.7细胞生长的作用影响。如图5a所示，细胞协同1.56～50.00μmol/L浓度的水平素D疏松染料木素对RAW264.7细胞无毒性，如图5b所示，染料3.12～100.00μmol/L浓度的木素维生素D3对RAW264.7细胞无毒性。
通过MTT法测定染料木素和维生素D3作用24h对破骨细胞增殖的维生影响。如图6a所示，骨质浓度在1.56～50.00μmol/L范围内染料木素对破骨细胞增殖具有显著抑制作用。作用如图6b、细胞协同6d所示，浓度在6.25～50.00μmol/L范围内维生素D3对破骨细胞增殖具有显著的促进作用，与染料木素联合使用后，这种促进作用受到抑制。与对照组相比，联合组在3.12～50.00μmol/L浓度下破骨细胞的增殖受到显著抑制，而在3.12～25.00μmol/L浓度下，与染料木素组相比，破骨细胞的增殖受到抑制。结果表明，维生素D3可以促进破骨细胞的增殖，但与染料木素结合可以抑制破骨细胞的增殖。
采用TRAP试剂盒测定药物作用于破骨细胞24h后对TRAP活性的影响。如图7所示，染料木素、维生素D3和联合用药组均显著抑制破骨细胞的TRAP酶活性。联合用药组相比单药抑制作用更强。
如图8a所示，与对照组相比，试验组中破骨细胞的TRAPmRNA表达均被抑制，且联合组的抑制作用更显著。如图8b所示，与对照组相比，试验组中对破骨细胞TRAPmRNA表达抑制作用随浓度增加而减弱。如图8c和8d所示，与对照组相比，试验组破骨细胞中MMP9mRNA的表达均被抑制，而与染料木素和维生素D3单组相比，联合组中MMP9mRNA的表达显著降低，并且当浓度增加时，抑制作用减弱。如图8e、8f所示，染料木素对破骨细胞中组织蛋白酶KmRNA的表达有明显的抑制作用，但在6.25～50.00μmol/L的浓度下，维生素D3却显著促进了组织蛋白酶K的表达。所以，染料木素逆转了维生素D3对组织蛋白酶KmRNA表达的促进作用，使联合组对其表达量明显降低。
试验数据显示染料木素和维生素D3联合使用比单独用药对成骨细胞的增殖具有显著的促进作用，同时也对破骨细胞有显著的抑制作用。证实染料木素和维生素D3对促进成骨细胞增殖和抑制破骨细胞增殖具有协同作用。维生素D3与染料木素联合用药作用于MG-63细胞，ALP活性明显增强，说明二者联合能促进成骨细胞的早期分化，与文献报道过的黄酮促进成骨细胞分化一致。通过10%的CPC将钙结节量化，得出联合用药能促进钙结节的生成，促进成骨细胞矿化。本文还测定了OPG、RANKLmRNA的相对表达量，并比较了不同浓度不同组的OPG/RANKL比值。发现维生素D3和染料木素联合可能是通过OPG/RANKL/RANK通路促进成骨细胞成熟，有待进一步研究。
本文通过对破骨细胞TRAP活性检测以及TRAP、MMP9、组织蛋白酶KmRNA的表达，发现维生素D3和染料木素联合用药能抑制破骨细胞的分化成熟。维生素D3在6.25～50.00μmol/L，可显著促进破骨细胞成熟和组织蛋白酶K的表达，同时显著抑制破骨细胞成熟的标记因子MMP9的表达。维生素D3和染料木素的组合可显著抑制破骨细胞的增殖和分化，染料木素在试验剂量内逆转了维生素D3对破骨细胞的促进作用。
本文证实，染料木素可增强成骨细胞MG-63的增殖和分化，从而促进抗骨质疏松作用。有趣的是，高剂量的维生素D3可促进破骨细胞的增殖成熟从而促进骨质疏松作用，但是在维生素D3和染料木素联合使用时，这种作用可以逆转，抗骨质疏松作用也很明显。染料木素和维生素D3在抗骨质疏松症上的协同作用提供了一种新颖而有效的组合，在骨质疏松症的饮食疗法中具有应用的潜力。
相关链接：维生素D，染料木素，蛋白酶K
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